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基因測序作為醫療健康行業(yè)的火爆技術(shù)，近年來(lái)越來(lái)越得到臨床的認可，并逐步被應用到各大領(lǐng)域中。尤其是精準醫療概念提出以后，基因測序更是備受青睞，它為精準醫療解答了很多未知的問(wèn)題。
如今，基因測序已經(jīng)形成了一定的產(chǎn)業(yè)規模，大量的企業(yè)以不同形式躋身進(jìn)來(lái)。但是，在表面飛速發(fā)展的背后，技術(shù)上仍有大量的挑戰。外媒《GEN》ShawnC.Baker博士撰文講解該領(lǐng)域面臨的困難與挑戰。編譯如下：
過(guò)去十年里，高通量測序技術(shù)經(jīng)歷了跨越式的發(fā)展，測序能力大幅上升，費用下降，兩者的變化都是數量級的。到目前為止，全球范圍內，共配備測序設備超過(guò)一萬(wàn)臺。
過(guò)去十幾年來(lái)，主要的平臺公司都致力于提升系統的易用性。Illumina的最新桌面系統，比如NextSeq、MiSeq、和MiniSeq系統，均通過(guò)試劑盒進(jìn)行操作，以減少了手工操作的次數和開(kāi)機時(shí)間。
一直以來(lái)，Illumina的系統都比賽默飛的IonTorrent系統更加易用，但后者最新的系統IonS5特別設計簡(jiǎn)化了整個(gè)工作流程，涉及設計準備庫到數據生成的整個(gè)流程。
行業(yè)外讀者在聽(tīng)聞了測序行業(yè)的許多進(jìn)展后，如強大的測序能力、更低的成本以及更好的易用性，可能會(huì )誤認為，基因測序所有的困難已經(jīng)都解決了，測序過(guò)程的所有障礙都移除了。
但是真正的困難還剛開(kāi)始，大量的挑戰在前方。
樣品質(zhì)量
問(wèn)題最嚴重的一個(gè)領(lǐng)域，也是易被忽略的是：樣品質(zhì)量，雖然測試平臺經(jīng)常會(huì )校準，使用的樣本也是經(jīng)過(guò)校準的，但是真實(shí)世界中的樣本經(jīng)常會(huì )面臨很多意想不到的挑戰。
在人類(lèi)基因測序中，一個(gè)最普遍使用的樣本類(lèi)型是FFPE(formalin-fixedparaffin-embedded)。FFPE的廣泛應用有多種原因，其中最重要的是豐富性。據估計，全球范圍內，有超過(guò)100億FFPE樣本存檔。FFPE塊的臨床樣本存儲已經(jīng)變成工業(yè)級別的標準實(shí)踐，其樣本數量將繼續保持增長(cháng)。
除全球范圍的廣泛應用外，FFPE樣本通常包含著(zhù)大量可用的表型信息。例如，FFPE樣本可與治療方法和臨床數據綜合應用。
但FFPE樣本出現的問(wèn)題是：固定過(guò)程和存儲條件均會(huì )造成大量的DNA損傷。
BioCule公司CEO、聯(lián)合創(chuàng )始人HansG.Thormar博士認為，
“評估了BioCule的QC平臺超過(guò)1000份樣本后，我們看到了DNA樣品中大量的變異和各種類(lèi)型的損傷，例如鏈間、鏈內交聯(lián)，單鏈DNA的聚合以及單鏈DNA破壞。”
“DNA損傷的變異數量和類(lèi)型，如果忽略，可能會(huì )對最終結果產(chǎn)生負面影響。”
Thormar認為，這對下游應用比如測序的影響是巨大的：從簡(jiǎn)單測序文庫構建的失敗到虛假文庫的產(chǎn)生，最終導致結果的錯誤。因此，在測序項目開(kāi)始時(shí)正確評估每個(gè)樣本的質(zhì)量變得至關(guān)重要。
測序文庫
盡管，各大測序平臺公司花大力氣在降低生成原始序列的成本上，但是在構建測序庫方面卻不然。人類(lèi)基因測序的測序文庫的構建，每個(gè)樣本大約花費50美元，在總花銷(xiāo)中是相對較小的一部分。但是在其他應用中，例如細菌基因組測序或低深度RNA測序，它占據總成本很大一部分。
幾個(gè)小組研究了多元化自制解決方案，期望可以有效降低成本，但在商業(yè)領(lǐng)域并沒(méi)有太多發(fā)展。在開(kāi)發(fā)單細胞測序解決方案中有一個(gè)亮點(diǎn)，例如10XGenomics公司的Chromium(TM)系統，利用基于珠的系統可以并行處理數百到數萬(wàn)個(gè)樣品。
10XGenomics公司的CEO兼聯(lián)合創(chuàng )始人SergeSaxonov博士堅持道，
我們認為單細胞RNA測序是進(jìn)行基因表達分析的正確方式，在接下來(lái)的幾年，全球許多地區，RNA試驗將轉向單細胞分辨率，我們的平臺有可能在這方面引領(lǐng)浪潮。
對于大型項目，比如在降低樣品成本方面，單細胞RNA測序中要求的高度多元解決方案將是關(guān)鍵的因素。
長(cháng)讀數與短讀數
Illumina對于基因測序市場(chǎng)的主導，意味著(zhù)到目前為止產(chǎn)生的絕大多數數據都基于短讀數(shortreads，高通量測序平臺產(chǎn)生的序列就稱(chēng)為reads，這是測序讀到的堿基序列片段，測序的最小單位)。大量短讀數的產(chǎn)生對大多數的應用都很適用。例如檢測基因組DNA的單核苷酸多態(tài)性和計數RNA的轉錄物。然而，在許多其他的應用中，僅有短讀數是不夠的，例如閱讀基因組的高度重復區域和確定長(cháng)鏈結構。
長(cháng)讀數平臺，例如PacificBiosciences公司的RSII和Sequel，OxfordNanopore的MinION，通常能生成15-20kb范圍長(cháng)度的讀數，最高曾報道過(guò)超過(guò)100kb長(cháng)度的讀數。這樣的平臺贏(yíng)得科學(xué)界的贊賞，例如加利福尼亞大學(xué)戴維斯分校細胞生物學(xué)教授CharlesGasser博士。
Gasser博士評論道，“我對于用長(cháng)讀數方法進(jìn)行基因組裝配的成功印象深刻，特別是與短讀數高保真數據相結合時(shí)的混合裝配中。技術(shù)的結合使得小群體、小預算的單個(gè)研究者從一個(gè)新的生物基因組中產(chǎn)生一個(gè)可用的組裝。”
為了充分利用這些長(cháng)讀數平臺，有必要通過(guò)新方法進(jìn)行制備DNA樣品，標準分子生物學(xué)方法尚未優(yōu)化用來(lái)分離超長(cháng)鏈DNA片段，所以，在制備長(cháng)讀數庫時(shí)必須特別小心。
例如，供應商創(chuàng )建了一種高分子量試劑盒用于分離大于100kb的的DNA片段，優(yōu)化靶向DNA方案來(lái)選擇性富集DNA的大片段，為了保證長(cháng)讀數產(chǎn)量的最大化，這些方法和技術(shù)必須掌握。
短讀數的一種特殊形式是鏈接讀數，例如10XGenomics，可作為真正長(cháng)讀數的一種替代方法。鏈接讀數是這樣產(chǎn)生的：每個(gè)長(cháng)DNA片段，通常大于100kb，其中產(chǎn)生的每個(gè)短讀數，均加入一個(gè)獨一無(wú)二的條形碼，在分析階段，這種獨特的條形碼就可以將分離的短讀數鏈接在一起，從而提供長(cháng)鏈基因信息，使得構建大單倍型塊和對復雜結構信息的闡釋成為可能。
Saxonov博士建議道，短讀數測序，因其高精確度和高通量，通常具有強大的功能，但只能獲取小部分的基因信息。這是因為基因組是基本重復的，基因組中的大量信息編碼在長(cháng)鏈中。
數據分析
研究人員面臨的領(lǐng)一大挑戰是生成的數據量非常大。單個(gè)30X人全基因組樣品的BAM文件(半壓縮比對文件)約為90GB；一個(gè)相對中等的項目，包含100個(gè)樣本，其BAM文件可達到9TB。
一個(gè)IlluminaHiSeqX儀器，每年能產(chǎn)生超過(guò)130TB的數據，很快數據的存儲就變成一個(gè)大問(wèn)題。例如，Broad研究所以每12分鐘分析一個(gè)30X人全基因組速率產(chǎn)生基因測序數據——每年可產(chǎn)生將近4000TB的BAM文件。
BAM文件可以轉化為VCF文件(變體調用格式)，后者僅包含不同于標準序列的信息。雖然VCF文件小并且更加好用，但是保存原始序列文件仍是必要的，方便研究者將來(lái)查看這些數據。
隨著(zhù)測序成本下降，一些人就得出這樣的結論：對樣本重測序會(huì )很容易，并且可能更便宜，而分析大量數據時(shí)，研究人員的選擇空間非常大。但事實(shí)上，在OMICtools中有超過(guò)3000個(gè)序列分析工具可供選擇，研究人員想要找到最好的那一個(gè)，也不容易。
臨床解釋和報銷(xiāo)
最后，對于臨床樣本，還有一個(gè)挑戰：對于測序序列的變異提供一致可靠的解釋。
一個(gè)典型的外顯子包含1萬(wàn)——2萬(wàn)個(gè)突變，全基因樣本則會(huì )產(chǎn)生超過(guò)300萬(wàn)種變異。在通常的解釋中，根據變異造成的疾病相似性分類(lèi)。
為了協(xié)助指導臨床醫生，美國醫學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)，分子病理學(xué)協(xié)會(huì )和美國病理學(xué)家學(xué)院創(chuàng )建了一套對突變進(jìn)行分類(lèi)的系統。分類(lèi)目錄包括致病性，可能致病性，不確定的顯著(zhù)性(目前占外源和全基因組樣本的絕大多數)，可能良性和良性。
然而，這種方案有其局限性。即時(shí)使用一種公認的分類(lèi)方案分類(lèi)同一個(gè)數據庫，不同的項目組可能會(huì )提出不同的解釋。對新系統的一個(gè)試驗研究中，參與的不同臨床實(shí)驗室僅在34%的情況下，對于分類(lèi)的解釋一致。
如果存在分歧或需要額外的分析來(lái)解釋實(shí)驗結果，那么就存在報銷(xiāo)的問(wèn)題?；贜GS的測試的報銷(xiāo)可能是一個(gè)大障礙，但是對于解釋的報銷(xiāo)幾乎是不可能的。
Rady兒童基因組醫學(xué)研究所臨床研究員JenniferFriedman博士說(shuō)，
實(shí)驗室不可能對試驗的解釋付費，如果這種服務(wù)可以提供，這是非常有價(jià)值的，但是沒(méi)有人做到這個(gè)。
沒(méi)有辦法為此付費，保險公司不報銷(xiāo)。盡管對于精準醫學(xué)的關(guān)注度上升，但是無(wú)論是臨床醫生或實(shí)驗室做出的解釋?zhuān)紱](méi)有被醫療保健支付者承認或是重視。
到目前為止，病人樣本的分析基本上是作為一個(gè)研究項目來(lái)對待的，是在研究型醫院中的一個(gè)選擇，并且僅用于有限數量的患者。
未來(lái)展望
了解道，盡管過(guò)去幾年有很大的進(jìn)步，但是整個(gè)NGS工作流程，從樣品文庫構建到數據分析，仍然存在大量的挑戰。隨著(zhù)基礎技術(shù)的進(jìn)步，新的挑戰將繼續出現，對于這些基因組技術(shù)的廣泛應用和最大化改善人類(lèi)健康而言，解決這些挑戰是至關(guān)重要的。
